實(shí)驗(yàn)一  DNA檢測(cè)

目的：

檢測(cè)DNA   

原理：

蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它們具有吸收紫外光的性質(zhì)，其吸收高峰在280nm波長處，且在此波長內(nèi)吸收峰的光密度值與其濃度成正比關(guān)系，故可作為蛋白質(zhì)定量測(cè)定的依據(jù)，但由于各種蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要準(zhǔn)確定量，必需要有待測(cè)蛋白質(zhì)的純品作為標(biāo)準(zhǔn)來比較，或且已經(jīng)知道其消光系數(shù)作為參考。

不少雜質(zhì)在280nm波長下也有—定吸收能力，可能發(fā)生干擾。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶堿)的影響更為嚴(yán)重。然而核酸的zui大吸收峰是在260nm。因此溶液中同時(shí)存在核酸時(shí)，必須同時(shí)測(cè)定OD260nm，與OD280nm。，然后根據(jù)兩種波長的吸收度的比值，通過經(jīng)驗(yàn)公式校正，以消除核酸的影響而推算出蛋白質(zhì)的真實(shí)含量。

實(shí)驗(yàn)方法：

采用紫外可見近紅外分光光度計(jì)中濃度掃描方式，按照?qǐng)D表配置標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

波長：280nm  直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取被測(cè)液體的光密度值

以標(biāo)準(zhǔn)管各管光密度值為縱坐標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)測(cè)定管光密度值，直接查標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣本中蛋白質(zhì)的含量。

計(jì)算方法一 

選一種與待測(cè)樣本蛋白質(zhì)氨基酸組成相近似的蛋白質(zhì)純品，用生理鹽水稀釋至濃度為 lmg／m1，作為稀釋標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。

用生理鹽水稀釋待測(cè)樣本蛋白質(zhì)至濃度約為lmg／m1，即為稀釋樣本蛋白質(zhì)溶液。

紫外近紅測(cè)試方法：

• 基線設(shè)置波長范圍250-290nm
• 選擇濃度掃描，

計(jì)算方法二

利用經(jīng)驗(yàn)公式直接計(jì)算

準(zhǔn)確吸取血清樣本0.1ml，置于50ml容量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度，即500倍稀釋，在280nm和260nm兩處波長分別測(cè)得光密度值、再按下列公式計(jì)算。
1、OD280／0D260＜1.5時(shí)，用Lowry-Kalokar公式：
樣本蛋白質(zhì)含量(mg／m1)＝1.45OD280一0.74OD260 
2、OD280／OD260﹥1.5時(shí)，用Lamber-Beer定律計(jì)算：
樣本蛋白質(zhì)含量(mg／m1) = OD280／K×L＝（OD280／6.3×1）×10g／L
本實(shí)驗(yàn)樣品：牛血清白蛋白E1%cm＝6.3（100ml／cm.g）
           K：克分子消光系數(shù)；E1%cm：百分比吸光度的吸光系數(shù)；
注：不同蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸含量有差異，故標(biāo)準(zhǔn)管與測(cè)定管的蛋白質(zhì)氨基酸組成應(yīng)相似，以減小誤差。